DNA testovi u kliničkoj medicini

Žensko zdravlje / Prevencija Ana-Maria Ivankov mag. biol. mol.

Neinvazivno prenatalno testiranje predstavlja revolucionaran doprinos genetike i napretka molekularno biološke tehnologije u prenatalnoj medicini i kliničkoj praksi

U Hrvatskoj je malo više od godinu dana dostupan Harmony Prenatal test - neinvazivni genetski test za trudnice kojim se utvrđuje rizik fetusa za Downov sindrom. U tom relativno kratkom vremenu testu je, zahvaljujući tvrtki Genom, u suradnji s velikim brojem poliklinika i ginekoloških ordinacija, pristupilo oko 400 pacijentica. Ovaj test, razvijen u tvrtki Ariosa Diagnostics u Kaliforniji 2012. godine, fascinantan je doprinos genetike i napretka molekularno biološke tehnologije u medicini i kliničkoj praksi.

Genetsko testiranje, široj javnosti još nedovoljno poznat pojam, polako ulazi u rutinsku medicinsku praksu i smatra se kako će vrlo brzo biti njezin neizostavan dio. Stoga valja upoznavati javnost s njegovim značenjem, prednostima i nedostacima, te vrstama testova i načinima njihova provođenja.

Specifičnost genoma ključ personalizirane medicine

Zahvaljujući projektu Humanog genoma (Human Genome Project), 2003. godine ‘pročitan’ je ljudski genom (svi nasljedni podaci sadržani u molekuli DNA). Uz mnoštvo novih informacija dobivenih tim projektom, jedna od zanimljivijih je da svi ljudi međusobno imaju gotovo identičan genom (99,9 posto), što bi značilo da se sva varijabilnost među pojedincima krije u samo 0,1 posto genoma! Upravo zahvaljujući toj sitnoj, ali ipak značajnoj varijabilnosti, svaki pojedinac ima jedinstvenu DNA po kojoj je poseban. Molekula DNA nosi točne upute za stvaranje i funkcioniranje određenog organizma sa svim svojim specifičnim svojstvima - određuje naš izgled, reakciju našeg tijela na okolinu (prehrana, lijekovi, tjelesna aktivnost), a djelomično i naše ponašanje.

Promjene koje se događaju u genomu najčešće ne utječu na organizam. Kad učinak postoji, češće je negativan nego pozitivan i može rezultirati pojavom bolesti. Postoji nekoliko tipova većih promjena u genomu, tzv. kromosomskih abnormalnosti, kao što su promjene u broju kromosoma, lomovi i premještanja velikih dijelova kromosoma s jedne pozicije na drugu. Međutim, promjene u molekuli DNA većinom su suptilne, kao što su promjene u slijedu na razini jednog nukleotida, tzv. SNP (Single Nucleotide Polymorphisms). SNP-ovi su česti u genomu i mogu utjecati na podložnost određenim bolestima i njihov razvoj, ali i na odgovor organizma na patogene organizme, kemikalije, lijekove, cjepiva i ostale tvari iz okoliša. Bitni su za razvoj personalizirane medicine, koja teži stvaranju individualiziranih terapija prilagođenih svakoj pojedinoj osobi prema specifičnostima njezina genoma. Molekularna dijagnostika, koja među ostalim obuhvaća genetsko testiranje, omogućava nam uvid u specifičnost svakoga pojedinoga genoma i zato je ključ personalizirane medicine.

Genetsko testiranje

Genetskim testiranjem identificiraju se promjene na razini kromosoma i gena. Zahvaljujući ubrzanom razvoju genetike i tehnologije u posljednjem desetljeću, trenutačno je u uporabi više od 1000 različitih genetskih testova, s tim da se svakodnevno razvijaju novi. Provode se iz uzoraka krvi, sline, bukalne sluznice (sluznica obraza), kose, kože, amnionske tekućine i drugih tkiva. U nastavku slijede osnovne vrste genetskog testiranja.

Dijagnostičko testiranje
Služi za potvrdu dijagnoze kad već postoje znaci i sumnje na određenu genetsku bolest. Primjer su testiranja gena za cističnu fibrozu, tešku nasljednu bolest koja zahvaća pluća, ili provjera viška kromosoma u slučaju Downova sindroma.

Prediktivno i/ili presimptomatsko testiranje
Prediktivnim testiranjem utvrđuje se rizik obolijevanja od bolesti koja se uglavnom javlja kasnije u životu (npr. neki tipovi karcinoma ili srčanožilnih bolesti). Rezultati testiranja mogu uputiti na provođenje preventivnih mjera kako bi se smanjio rizik razvoja bolesti. Presimptomatsko testiranje podrazumijeva genetsko ispitivanje osoba koje nemaju simptome bolesti, ali je bolest prisutna u obitelji (npr. Huntingtonova bolest, za koju se genetskim testom može doznati rizik od obolijevanja, iako, nažalost, još ne postoji terapija koja bi spriječila pojavu bolesti).

Promjene koje se događaju u genomu najčešće ne utječu na organizam. Kad učinak postoji, češće je negativan nego pozitivan i može rezultirati pojavom bolesti

Testovi novorođenčadi (screening testovi)
Provode se radi utvrđivanja genetskih poremećaja koji se mogu liječiti u mlađoj dobi. Primjer je fenilketonurija, nasljedna metabolička bolest koja može dovesti do teškog oštećenja mozga. Ako se u djetetovoj prehrani od rođenja izbjegavaju namirnice koje sadrže aminokiselinu fenilalanin, dijete će se normalno razvijati.

Testovi nositelja (carriertesting)
Služe za planiranje obitelji. Testiraju se zdravi budući roditelji ako su u krvnom srodstvu s osobom oboljelom od neke recesivne bolesti (npr. cistična fibroza, srpasta anemija i beta-talasemija). Rezultat ovakvih testova utvrđuje rizik obolijevanja potomaka. Ako su oba roditelja nosioci recesivne mutacije odgovorne za razvoj bolesti, vjerojatnost obolijevanja potomstva je 25 posto.

Prenatalno testiranje
Provodi se tijekom trudnoće za testiranje genetskih poremećaja kod fetusa. Da bi se dobio genetski materijal fetusa, provode se amniocenteza (uzimanje uzorka plodne vode) ili biopsija korionskih resica (uzimanje uzorka korionskih resica iz posteljice), a u novije vrijeme fetalna DNA izolira se iz majčine krvi.

Primjena - primjer prenatalne dijagnostike

Kariotipizacija
Genetsko testiranje u prenatalnoj dijagnostici provodi se još od 1968. godine, kad je uvedena metoda kariotipizacije. Kariotipizacija je mikroskopska analiza embrionskih stanica kojom se utvrđuje postojanje kromosomskih abnormalnosti (najpoznatiji primjer je trisomija 21 koja uzrokuje Downov sindrom). Iako izuzetno pouzdana metoda (97,5-99,8 posto), kariotipizacija zahtijeva embrionske stanice koje se dobivaju invazivnim metodama - iz korionskih resica (metodom biopsije korionskih resica) ili iz plodne vode (amniocenteza) - što sa sobom nosi povećan rizik od pobačaja. Također, kariotipizacija se provodi relativno kasno u trudnoći - od 16. do 18. tjedna (ako se radi o amnicentezi) ili od 11. do 14. tjedna (u slučaju biopsije korionskih resica), uz dodatno potrebno vrijeme za dobivanja rezultata, što iznosi oko dva tjedna. Zbog navedenih nedostataka kariotipizacije, sustavno se razvijaju tehnološki naprednije metode, iako još niti jedna nije u potpunosti zamijenila kariotipizaciju u kliničkoj praksi.

Novije metode - FISH i qfPCR
Dvije tehnološki naprednije metode, koje se već godinama koriste kao metode komplementarne standardnoj kariotipizaciji u kliničkoj praksi, su fluorescentna in-situ hibridizacija (FISH) i fluorescentna kvantifikacijska lančana reakcija polimeraze (qfPCR). Te dvije tehnike zasnivaju se na detekciji kromosomskih abnormalnosti pomoću fluorescentnog obilježavanja. Iako su vrlo korisne i brze, nedostatak im je što omogućuju samo ciljanu detekciju (ne analizira se cijeli genom nego samo predefinirani kromosomi/geni). Stoga su pogodne kao potvrdne metode za već utvrđenu dijagnozu ili za brzo dobivanje rezultata kad postoji snažna indikacija za određeni poremećaj (npr. Downov sindrom i ostale promjene broja kromosoma).

Kromosomski mikročip (microarray)
Poput klasične kariotipizacije, kromosomski mikročip služi za detekciju kromosomskih anomalija na razini cijeloga genoma. Zasniva se na vezanju fragmenata fetalne DNA za velik broj proba (kratkih sintetski dobivenih DNA molekula) poznatih pozicija u genomu, što dovodi do signala čiji je intenzitet mjerljiv i odgovara količini vezane DNA na svakoj poziciji. Iako je i dalje riječ o invazivnoj metodi (zahtijeva izolaciju embrionskih stanica), ima veću moć razlučivanja od kariotipizacije, daje puno više korisnih informacija i ne zahtijeva kultivaciju stanica, što znatno skraćuje analizu. Nedostatak je postojanje velike količine informacija kojima se još jasno ne zna klinički značaj, što donekle otežava interpretaciju konačnih rezultata.

Neinvazivno prenatalno testiranje (NIPT)
U posljednjih nekoliko desetljeća nastoje se osmisliti neivazivni prenatalni genetski testovi iz majčine krvi koji bi zamijenili invazivne testove (koji za izolaciju embrionskih stanica koriste npr. amniocentezu). Prisutnost fetalnih stanica u majčinoj krvi i mogućnost njihove uspješne izolacije tijekom trudnoće prvi se put spominju 1969. Međutim, razina fetalnih stanica u majčinoj krvi je jako niska i varijabilna, što je velik nedostatak za njihovu širu uporabu u genetskom testiranju. Znanstvenici su 1997. uspješno detektirali slobodna fetalna DNA (cfDNA, cell-free DNA) u majčinoj krvi tijekom trudnoće, u 20-25 puta većoj koncentraciji od koncentracije fetalnih stanica. Nekoliko različitih laboratorija uspješno je demonstriralo uporabu metoda sekvencioniranja druge generacije za detekciju i kvantifikaciju kromosoma 21 (Downov sindrom), kromosoma 18 (Edwardsov sindrom), kromosoma 13 (Patau sindrom), promjene broja spolnih kromosoma i određivanje spola iz fetalne cfDNA iz majčine krvi tijekom trudnoće. Ako je količina tih kromosoma povećana u odnosu na ostale, vrlo vjerojatno je riječ o promjeni broja tog kromosoma.

Prije svakoga genetskog testiranja preporučuje se savjetovanje s genetičarom ili genetskim savjetnikom kako bi pacijent mogao pravilno razumjeti rezultate testa i njihovo značenje, te biti emocionalno pripremiti


Prednosti neinvazivnoga prenatalnog testiranja iz majčine krvi su sigurnost za majku i dijete, velika pouzdanost, ranija mogućnost izvedbe (već od desetog tjedna trudnoće) i brzina dobivanja rezultata. Ipak, ne radi se o dijagnostičkoj metodi, nego je u slučaju pozitivna rezultata potrebna potvrda putem kariotipizacije.

Postoji nekoliko komercijalno dostupnih neinvazivnih prenatalnih testova za detekciju navedenih sindroma. Jedan od njih je već spomenuti Harmony Prenatal test, koji je razvila američka tvrtka Ariosa Diagnostics. Nedavno su znanstvenici te tvrtke unaprijedili metodu uvođenjem mikročip tehnologije u analizu kromosoma, što je rezultiralo poboljšanom učinkovitošću, skraćivanjem vremena potrebnog za dobivanje rezultata te preciznijem određivanju koncentracije cfDNA. To je prvi primjer uporabe mikročip tehnologije u neinvazivnom prenatalnom testiranju iz majčine krvi.

Zbog sigurnosti i jednostavnosti, neinvazivno prenatalno testiranje vrlo je brzo prihvaćeno u kliničkoj praksi, a prihvatili su ga i liječnici i pacijentice (kao što je na početku navedeno, oko 400 pacijentica se odlučilo za Harmony Prenatal test u prvih godinu dana njegove dostupnosti u Hrvatskoj). Iako predstavlja vrhunski tehnološki napredak, ovo je vjerojatno samo početak molekularno-bioloških mogućnosti koje se otvaraju u prenatalnoj dijagnostici. Već se razvijaju metode sekvenciranja ukupne fetalne DNA, što analize fetalnoga genoma ne bi ograničavalo samo na kromosomske abnormalnosti, nego bi omogućilo detekciju i puno manjih, suptilnijih promjena na fetalnoj DNA. Ili, drugim riječima, bit ćemo u mogućnosti ‘pročitati’ čitav genom fetusa. Dakle, budućnost svakako nosi velike promjene u dijagnostici bolesti, ali nesumnjivo donosi i mnoge etičke dvojbe.

Genetsko savjetovanje prije testiranja

U konačnici, važno je razumjeti da, uza sve prednosti koje donosi genetsko testiranje, postoje određena ograničenja i rizici. Rezultati ovakvih testova nisu uvijek jednoznačni, što otežava njihovu interpretaciju i može izazivati nelagodu i skeptičnost prema genetskom testiranju.

Uz rezultate testa, za pravilnu dijagnozu mora se uzeti u obzir povijest bolesti pacijenta, njegove obitelji i tip samog testa. Prije svakoga genetskog testiranja preporučuje se savjetovanje s genetičarom ili genetskim savjetnikom kako bi pacijent mogao pravilno razumjeti rezultate testa i njihovo značenje, te biti emocionalno pripremljen. Budućnost svakako nosi velike i uzbudljive pomake u onome što nudi genetika, a mi samo moramo biti spremni i nositi se s novim informacijama i mogućnostima na etički ispravan način.

Datum objave članka: 1. 3. 2015.